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Direct RNA 測序(DRS)揭示擬南芥mRNA加工和m6A


研究背景
 
mRNA前體的加工和堿基修飾決定了真核生物mRNA的編碼潛力和命運。可變轉錄本是同一基因由于轉錄起始位點、剪接位點和Poly(A)長度以及剪切到成熟mRNA的外顯子組合等因素產生的。RNA修飾在基因表達上下游的活動中起著關鍵的作用,m6A是mRNA最豐富的修飾,傳統的RNA-seq無法識別m6A修飾。


實驗設計

人工合成RNA評估方法的可行性
人工合成的已知含量和Poly(A)長度不含有修飾位點的RNA MALAT1 Cntrl和只含有一個m6A修飾位點的RNA MALAT1 m6A。使用Nanopore對RNA直接進行測序(Direct RNA 測序,簡稱DRS),評估Direct RNA 測序能否準確鑒定Poly(A)長度和對RNA準確定量。同時開發m6A分析方法。




對樣品進行分析

分別選取野生型擬南芥(Col-0),m6A修飾缺陷突變體(vir-1)和在vir-1中線性表達缺失蛋白恢復功能的補體(VIRc)。分別進行Direct RNA 測序和Illumina RNA測序,對isoform、正反義鏈、可變剪切、Poly(A)長度、m6A修飾進行分析。
 


研究結果
 
數據統計


對4個生物學重復的Col-0幼苗含有Poly(A) 的RNA進行富集,將外部合成的RNA(ERCC)加入樣品中。使用Nanopore直接對RNA進行測序;同時使用Illumina 進行RNA測序。Direct RNA測序每個樣品產生1M左右的reads。mRNA的最長reads比對為12.7kb,跨越63個外顯子;和12.8kb,跨越58個外顯子,代表了從擬南芥中測序的一些最長的連續mRNA。最短的序列是非編碼RNA序列。
 

使用2個ERCC(MALAT1 m6A和MALAT1 Cntrl)對測序數據準確性進行評估,定量一致性是92%。使用Illumina糾錯后,定量一致性提高。

 
在納米孔DRS中假反義很少見或不存在

Direct RNA 測序0.02%的ERCC reads 比對到了反義鏈,19665條高表達的RUBISCO ACTIVASE序列沒有1條比對到反義鏈。因此可以確定假反義RNA在Direct RNA數據中是罕見的或不存在的。這簡化了對真實反義RNA的解釋,這在擬南芥中很重要,因為cDNA的測序方式對于正反鏈的識別是很困難的。通過Direct RNA測序,可以識別擬南芥的非編碼反義RNA,例如PIN4和PIN7的反義RNA。


Direct RNA 測序可以準確識別3’末端的位置并估計了Poly(A)尾長

 

 

首先使用合成的ERCC RNA評估Poly(A)長度的準確性,ERCC-00002的預期Poly(A)尾長為24nt,ONT測序得到的中值為23.3nt;ERCC-00074的預期Poly(A)尾長為24nt,ONT測序中值為27.4nt。結論是,對Poly(A)尾長的估計的中位值在幾個堿基內是準確的,但是有個別read 有很大誤差。

分別對總mRNA、葉綠體和線粒體編碼RNA的poly長度進行評估,長度的中位數和范圍分別是,68nt(13-200nt);13nt(3.1-56);20nt(4.1-73)。細胞器轉錄本的Poly(A)長度與RNA衰變符合。還發現Poly(A) 長度與基因表達負相關。
 



可變剪切分析和isoform

在全基因組范圍內比較Direct RNA 測序和作者以前使用Helicos數據比對到3’末端的位置,發現總體分布類似(二者之間的平均距離為0±13 nt)。
 
二代RNA-seq對于Poly(A)的位點和真實特征容易造成誤判,在DRS數據中,是非常罕見或不存在的。在10116條序列中,只有4條具有13nt內的reads比對。其中,2條進行糾錯后未被檢測到(這表明它們是由對齊錯誤引起的),另外2條映射到編碼序列注釋的末端外顯子,這表明它們可能是真實的3’末端。因此DRS對3’末端的檢測是準確的。
 



DRS揭示了復雜的RNA剪切

在單reads中,Nanopore測序揭示了擬南芥已報道的最復雜的剪接組合。例如,糾錯后的reads揭示了由63個外顯子組成的12.7kb序列的剪接模式,與Araport11中注釋的AT1G48090.4亞型完全一致。還檢測到FLM(AT1G77080)的互斥選擇性剪接,一些是已經注釋的,其中11個是新發現亞型。使用Illumina數據糾錯后的數據鑒定的39061個剪切位點(13%)是數據庫中沒有注釋的,因此糾錯后的數據是可以對擬南芥的剪切類型進行準確鑒定的。
Direct RNA測序在4個Col-0樣品中檢測到的多數剪切位點(Araport11注釋的75%和AtRTD2注釋中的69%)是在Illumina RNA-seq 也可以檢測到,其中81%是典型的GU/AG位點。Direct RNA測序和Illumina RNA-seq同時發現了3234個新的剪切位點,對其中3個RT-PCR和Sanger 測序進行驗證,發現是真實的剪切位點。



因此,這種方法定義了由已知剪接位點的替代組合產生的剪接模式(包括內含子保留)。發現了8659個新的剪切形式,其中的50%(4293)由已知剪接位點(Araport11或AtRTD2注釋的剪切位點)的替代組合產生的剪切模式(包括內含子保留)。




接下來,作者研究DRS檢測的可變剪切的是否具有功能。作者確定了新無義介導的mRNA降解(NMD)和提前終止密碼子(PTC)。 例如,編碼KH結構域蛋白的mRNA處的外顯子跳躍(AT5G56140)和編碼XRCC的mRNA處的AT1G80420)PTC插入。
 
總之DRS可以揭示全長mRNA背景下更復雜的剪切類型,不過需要二代數據進行糾錯。

m6A修飾檢測

基于合成的RNA,作者開發了m6A修飾鑒定的方法,并在全轉錄組范圍內繪制m6A修飾圖譜。發現使用抗體富集的方法無法檢測的新的motif類型AGAUU。為確定檢測m6A修飾檢測的有效性,使用miCLIP分析了2個Col-0樣品。66%的DRS檢測位點落在miCLIP峰的5nt范圍內。得出結論,DRS數據可以在轉錄組范圍內檢測m6A修飾。作者同時對測序覆蓋深度和甲基化的檢測做了評估。
 
缺陷m6A擾亂基因表達模式并延長晝夜節律

通過定量分析發現vir-1中基因整體的表達水平較VIRc低。因此m6A有利于mRNA穩定與人類促進mRNA衰變不同。正確控制生物節律、開花時間和FLC的調節模塊最終需要m6A的修飾,并且與Poly(A)長度有關。
 


m6A的缺失干擾RNA 3’末端形成

在vir-1中RNA 3’末端形成明顯缺陷。在vir-1突變體中鑒定了3579個基因中Poly(A) 發生變化, 3008變短,只有571變長。與Illumina測序的結果一致(3408個基因的Poly(A)變短,166個變長)。同時發現了vir-1突變體3'末端位置的改變可能是m6A缺失造成的。
 

參考文獻

Parker M T. et al. Nanopore direct RNA sequencing maps the complexity of Arabidopsis mRNA processing and m6A modification. eLIFE 2020 9: e49658. DOI:https://doi.org/10.7554/eLife.49658.
 
 
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