QTG策略的研究步驟

候選基因定位：
通過玉米自交系HZS和1462，構建F₂分離群體，混池測序，使用LOD閾值3.7，檢測了位于染色體1、3、6和7上的4個QTL，分別解釋了總表型方差的11.22%、7.49%、9.39%和16.60%。衍生F2:3家系的分析，驗證了4個QTL位點的可靠性。同時，選擇LOD值最高的QTL(在F₂群體中為11.99)，位于7號染色體上(以下簡稱qPH7)，采用QTG-seq策略進行精細等位。使用12個分子標記，篩選出813個在qPH7處為雜合子，在其他QTL處為純合子的BC1F1個體。選擇15株，自交，構建BC1F1:2家系，表型分析進行極端混池構建，混池測序（>280×）檢測到197,021個高質量SNP位點。smooth LOD及ED⁴分析7號染色體上只有一個峰，位置在135,216,475 bp處，屬于Zm00001d020874基因區域，其編碼一個含有NF-YC-結構域的蛋白，其擬南芥同源物已被報道影響開花時間。ED分析表明，qPH7候選基因位于峰值位置周圍的300-kb區間，該區間包含13個基因，也包括Zm00001d020874基因。

qPH7的精細定位和候選基因挖掘

候選基因驗證：
使用RNA-seq，評估兩個親本中300-kb區間內的任何候選基因是否存在表達的顯著差異。在莖頂端分生組織(SAM)和節間分生組織中，Zm00001d020874的表達量均具有顯著的差異。根據其擬南芥同系物在控制開花時間方面的已知功能和由smoothLOD算法識別出的強精細定位信號，我們認為Zm00001d020874是qPH7的強候選信號。為了核實Zm00001d020874在qPH7位點上的功能，構建了一個由RNA指導的CRISPR-Cas9表達載體，以Zm00001d020874外顯子上的兩個區域為目標，對野生型玉米自交系CAL1進行轉化，獲得兩棵轉基因陽性植株T13和T16。轉基因植株株高顯著低于對照組，支持Zm00001d020874是qPH7功能基因的假設。對親本HZS和1462中的Zm00001d020874序列分析發現6個變異位點，對181個從Chinese association mapping panel上獲得的自交系進行RNA測序分析，表明3個基因型之間Zm00001d020874的表達量存在顯著差異，且植株高度和Zm00001d020874的表達量存在顯著相關性。類似的現象在穗高和發育時間參數—花粉脫落日、吐絲日和抽穗日等性狀上發現，表明Zm00001d020874基因在株高上的影響可能與生殖發育有關。選擇足跡分析揭示Zm00001d020874在玉米改良過程中受到選擇

候選基因的驗證
 

研究意義：
QTG-seq只需要4代就可以達到基因的精細定位，其速度可與質量性狀的基因相媲美。因此，與其他方法相比，QTG-seq是一種更強大的快速QTL精細定位的方法。


參考文獻:
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